|
| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC4245 |
| 規格 | 100T/96S | 供貨周期 | 現貨 |
| 主要用途 | ATP-檸檬酸裂解酶活性檢測 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4245
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體110mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑五 | 液體10 μL×1支 |
溶液的配制：
1、 提取液二：為易揮發試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；
2、 試劑二：臨用前取1支加入0.5mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
3、 試劑三：臨用前取1瓶加入2.25 mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
4、 試劑四：臨用前取1支加入0.5 mL試劑一，充分溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
5、 試劑五：使用前請先離心再用移液槍吹打混勻。取3 μL試劑五加1000 μL蒸餾水充分混合（約100T），現用現配，也可根據樣本量按比例配制；
6、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根據樣本量現配現用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。
產品說明：
ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰輔*A的關鍵胞質酶，其催化產生的乙酰輔*A是合成脂肪酸與膽*醇等脂類物質的主要原料，并可參與相關重要蛋白的修飾作用，是體內能源物質代謝的樞紐性物質。在ATP和輔*A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰輔*A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，導致340nm處光吸收下降。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、天平、臺式低溫離心機、微量石英比色皿/96孔UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養箱、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
2、細胞或細菌：按照細胞或細菌數量（104個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細胞或細菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
3、血清（漿）或其他液體：直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 將試劑一置于37℃水浴10min。
3、 操作表 (在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列試劑) ：
試劑名稱 | 測定管 | 空白管 |
試劑一（µL） | 152 | 152 |
試劑二（µL） | 4 | 4 |
試劑三（µL） | 20 | 20 |
試劑四（µL） | 4 | 4 |
試劑五（µL） | 10 | 10 |
樣本（µL） | 10 | - |
蒸餾水（µL） | - | 10 |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培養箱2min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定130s時的吸光值A2，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 | ||
注意：如果樣本量大，可按試劑一︰試劑二︰試劑三︰試劑四︰試劑五=152︰4︰20︰4︰10的比例配制成工作液使用，工作液應根據樣本量現配現用。
三、ACL活性計算
A、按微量石英比色皿計算：
1. 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位
ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/g 質量）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA÷W
3. 按照細胞數量計算
單位定義：每1萬個細胞或細菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/104 cell）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）] ÷(N×V樣÷V樣總) ÷T=1607.7×ΔA÷N
4. 按液體體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷V 樣÷T=1607.7×ΔA
V反總：反應總體積，2×10-4L；109：單位換算系數，1mol=109nmol；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數量，以萬計；T：反應時間，2min。
B、按照96孔UV板計算
5. 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位
ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=2679.5×ΔA÷Cpr
6. 按樣本質量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/g 質量）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2679.5×ΔA÷W
7. 按照細胞數量計算
單位定義：每1萬個細胞或細菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/104 cell）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）] ÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=5.359×ΔA
8. 按液體體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷V 樣÷T=2679.5×ΔA
V反總：反應總體積，2×10-4L；109：單位換算系數，1mol=109nmol；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數量，500萬，T：反應時間，2min。
實驗實例：
1. 取0.1g黑麥草，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.7569-1.7034=0.0535，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0535-0.002=0.0515，按樣本質量計算得：ACL活性（U/g 質量）=1607.7×ΔA÷W=827.9655 U/g 質量。
2. 取0.1g肝臟組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.2341-1.0503=0.1838，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1838-0.002=0.1818，按樣本質量計算得：
ACL活性（U/g 質量）=1607.7×ΔA÷W=2922.7986 U/g 質量。
相關系列產品：
BC0750/BC0755 乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒
BC0410/BC0415 乙酰輔*A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒
BC1980/BC1985 總膽*醇（TC）含量檢測試劑盒
ATP-檸檬酸裂解酶活性檢測試劑盒 微量法 ATP-檸檬酸裂解酶活性檢測試劑盒 微量法
地址：北京通州區馬駒橋聯東U谷景盛南四街15號85A三層
郵箱：3193328036@qq.com
傳真：
